تولید هورمون رشد انسانی نوترکیب از سلول یوکاریوت و پروکاریوت

هورمون رشد انسانی یا سوماتوتروپین یک پروتئین تک رشته دارای 191 اسیدآمینه به صورت یک ساختار با 4 هلیکس دارای دو پل دی‎سولفیدی و وزن مولکولی حدود 22 کیلودالتون می‎باشد که توسط سلول‎های سوماتوتروف غده هیپوفیز ساخته شده و به جریان خون آزاد می‎شود. به علت فعالیت‎های بیولوژیکی مهم ومتنوع هورمون رشد، این هورمون دارای کاربردهای گسترده‎ای در پزشکی و بیوتکنولوژی می‎باشد. coli escherichia یکی از میزبان های اصلی برای تولید پروتئین خارجی است و از آنجایی که فرم فعال هورمون رشد به صورت غیرگلیکوزیله است، سیستم های بیان پروکاریوتی برای بیان این نوع پروتئین ها ترجیح دارد. از طرفی سلول‎های کشت شده پستانداران به خاطر تواناییشان در ایجاد ساختار صحیح پروتئین، تجمع و اصلاحات پس از ترجمه‎ای، سیستم مطلوب برای تولید پروتئین‎های نوترکیب با کاربردهای کلینیکی هستند. بنابراین زمانیکه یک پروتئین در سلول‎های پستانداران بیان می‎شود کیفیت واثر بهتری دارد در مقایسه با زمانیکه در سایر میزبان‎ها از جمله باکتری‎ها، گیاهان و مخمر بیان می‎شود. سیستم های گزارشگر ژنتیکی به عنوان ابزاری برای مطالعه ی تنظیم و بیان ژن ها در سلول های یوکاریوتی می باشند. ژن های گزارشگر دارای کاربردهای ویژه ای هستند و اغلب به عنوان شاخصی برای فعالیت رونویسی در سلول ها به کار می روند. در این تحقیق ابتدا هورمون رشد انسانی نوترکیب دارای توالی his-tag در سه سویه پروکاریوت (e.coli) شامل top10 ، xl1-blue وjm109 و در دو محیط کشت lb و4yt تولید و بهترین سویه تولید کننده rhgh با روش های dot blot،elisa ، sds-page وwestern blot تعیین شد. در ادامه طی یک فرایند کلونینگ توالی his-tag از وکتور حذف و مجدداً subclone تولید شده در سویه ی top10 بیان شد. و در نهایت هر دو نوع هورمون نوترکیب تولید شده در سلول پروکاریوتی به روش کروماتوگرافی ستون نیکل (برای نوع دارای توالی هیستیدین) و ژل فیلتراسیون (برای نوع طبیعی) خالص شدند. در ادمه تولید یوکاریوت هورمون رشد نوترکیب توسط یک کلون پایدار از سلول های cho ترانسفورم شده با وکتور pseqtaq انجام و با روش هایی مانند elisa، تولید آن اثبات گردید. سپس فعالیت زیستی هر دو نوع rhgh پروکاریوت و یوکاریوت به روش سیستم گزارشگر ژنی (سیستم گزارشگر lhre-tk-luc) بررسی شد. این سیستم شامل lhre (عامل اتصال یابنده به مولکول stat5) مشتق شده از پروموتور ژن بتاکازئین، پروموتور tk و ژن تحت کنترل آن، luc کدکننده برای آنزیم فایرفلای لوسیفراز می باشد و امکان بررسی و اندازه گیری انتقال پیام ایجاد شده توسط gh در سلول های ترانسفورم شده با ژن ghr را فراهم می کند. برای این منظور از سلول های hek293 ترانسفکت شده با گیرنده هورمون رشد استفاده شده و فرایند انتقال پیام درون سلولی القا شده توسط rhgh و در نتیجه آن بیان آنزیم لوسیفراز و به دنبال آن تولید نور توسط دستگاه لومینومتر اندازه‎گیری شد. نتایج حاصل از سیستم بررسی فعالیت زیستی نشان دادند که هر دونوع rhgh پروکاریوت و یوکاریوت به خوبی فرایند سیگنالینگ درون سلولی را القا می کنند اما در مقایسه با یکدیگر، نوع یوکاریوت دارای فعالیت زیستی بهتری می باشد.